כתבה: אלוירה בר מעבדה בהנדסה גנטית חלק מעשי ערכה: ד"ר דליה פפיר-קריכלי עזרה בהפקה: ענבר רכס כללי זהירות במעבדה לפני ביצוע כל סעיף, קרא היטב את ההוראות וודא שאתה יודע בדיוק את אשר יש לעשות. במידה ומתעוררות שאלות אל תהסס לפנות לצוות ההדרכה..1 שים לב, בעת הכנסת הפיפטה למשאבה הירוקה, החזק את הפיפטה בחלקה העליון. אל.2 תפעיל כוח בעת הכנסת הפיפטה למשאבה פן תשבר ותפצע אותך. אין לשתות/לאכול/לעשן במעבדה! טיפול בכלים משומשים ובפסולת: כל פסולת שבאה במגע עם חומר חיידקי - הכנס לשקית המסומנת ב-"פסולת בקטריולוגית.3.4 להשמדה." כל כלי שבא במגע עם חומר חיידקי - הכנס לכלי המונח ליד הכיור, הכלים יעברו שטיפה וסטריליזציה. כל פסולת שלא באה במגע עם חומר חיידקי - הכנס לפח אשפה כללי. את הכלים שלא באו במגע עם חומר חיידקי - השאר על המגש בצורה מסודרת. הקפד לרחוץ את ידיך במים וסבון בתום המעבדה. במקרה של תקלה כלשהי, כולל אי תקינות של מכשיר, קרא מיד למישהו מצוות ההדרכה...6 שלבי העבודה במעבדה חלק I: הפקת DNA פלסמידי DHα E. coli בחלק זה של המעבדה נפיק DNA פלסמידי מתרבית חידקי מזן. הנושאים את הפלסמיד puc 19 פלסמיד זה נושא שני גנים. האחד מקנה עמידות לאנטיביוטיקה אמפיצילין והשני מבטא את האנזים.β-galactosidase אנזים זה מפרק לקטוז לגלוקוז וגלקטוז. חלק :II אנליזה של DNA באלקטרופורזה בג'ל בחלק זה נחתוך את הפלסמיד בעזרת אנזים הגבלה ונבצע אנליזה של ה DNA ע"י DNA הרצה על גבי ג'ל. בין השאר נשווה בין ה- DNA שנפיק במעבדה לבין זהה המסופק מסחרית. חלק :III טרנספורמציה של חידקים קומפטנטיים DNA שיופק בחלק הראשון ישמש לטרנספורמציה לחיידקי.E coli קומפיטנטיים. במקביל נבצע ביקורת שלילית וביקורת חיובית. הביקורת החיובית תהיה טרנספורמציה באמצעות DNA פלסמידי מסחרי. ביקורת שלילית תהיה טרנספורמציה של חיידקים ללא DNA פלסמידי. זכויות שמורות למרכז נוער ע''ש בלמונטה
חלק 1: הפקת DNA שלבי עבודה במבחנה שבסל הקרח המסומנת באות R מצויה תרבית חיידקי.E coli מזן DHα הנושאים את הפלסמיד.pUC19 פלסמיד זה מכיל גן המקנה עמידות לאנטיביוטיקה אמפיצילין וכן גן המקודד לאנזים ביתא-גלאקטוזידאז. החיידקים גודלו במשך הלילה במצע גידול נוזלי LB אשר הכיל אמפיצילין. מתוך תרבית זו נבודד את ה DNA הפלסמידי. שלב א' : השקעת תאים עקוב אחר ההוראות שלב אחר שלב וסמן לצד כל סעיף אותו סיימת לבצע. קיצורי דרך עשויים למנוע את הצלחת הניסוי. בשלב זה נשקיע את החיידקים ונפריד בינם לבין המדיום בו הם גדלו. סימון מבחנות: בעזרת עט סימון סמן שתי מבחנות אפנדורף גדולות במספרים: 1,2. שים לב לצבע המבחנות של קבוצתך שכן המבחנות יוכנסו לצנטריפוגה יחד עם מבחנות של קבוצות אחרות. כיוון הפיפטור: כוון את הפיפטור של 1 מיקרוליטר חלוקת תרבית החיידקים למבחנות: ל- 9 מיקרוליטר והלבש טיפ כחול. בעזרת הפיפטור שכיוונת בשלב הקודם, העבר פעמיים לכל אחת מהמבחנות שסימנת 9 מיקרוליטר של תרבית חיידקים לקבלת נפח סופי של 18 מיקרוליטר (1.8 מיליליטר). שים לב: המבחנה תתמלא כמעט לגמרי ולכן בכדי שהחומר לא ישפך המנע מלהכניס את הטיפ עמוק לתוך הנוזל שבמבחנת האפנדורף. זרוק את הטיפ הכחול ל"שקית לאשפה בקטריולוגית". סגור את המבחנות היטב. השקעת החיידקים (העזר במדריך): הכנס את המבחנות לצנטריפוגה וסדר אותן כך שהציר הבולט של המכסה פונה החוצה. הקפד על איזון המבחנות בתוך הצנטריפוגה (חלוקה סימטרית של המבחנות בתאים). סרכז למשך שתי דקות בטמפ' החדר במהירות של 13, סל"ד. הפרדת המשקע מהנוזל העליון (הזהר לבל תפגע במשקע! ): שפוך בזהירות את הנוזל העליון לתוך כלי הפסולת הבקטריולוגית על ידי ניעור המבחנה מעל לכלי. לאחר מכן הפוך את המבחנות והנח אותן על גבי נייר סופג כדי לסלק את הטיפות האחרונות. חזור על שלבים 3- כדי להגדיל את מספר החיידקים. 9 1.1.2.3.4..6 זכויות שמורות למרכז נוער ע''ש בלמונטה
7. שלב ב' : פיצוץ עדין של התאים והידרוליזה של מולקולות RNA שלב זה כולל הוספה של 3 תמיסות שונות: תמיסה מספר Buffer) 1 (D1 מכילה בופר Tris-HCl ו EDTA שתפקידם לספק סביבה מתאימה לפירוק עדין של התאים. בנוסף, מכילה התמיסה אנזים RNase A המפרק את מולקולות ה.RNA תמיסה מספר Buffer) 2 (D2 מכילה SDS ו NaOH וגורמת לפירוק קרומי התא. תמיסה מספר Buffer) 3 (D3 מכילה protease ותפקידה לפרק את החלבונים שבתא..8.9 כיוון הפיפטור: כוון את הפיפטור של 1 הוספת תמיסה מס' 1 והרחפת המשקע: ל- 2 מיקרוליטר הוסף 2 מיקרוליטר של "תמיסה מספר Buffer) 1 (D1 ". והלבש טיפ כחול. הרחף את המשקע ע"י העלאת והורדת הנוזל בפיפטור (במידת הצורך העזר במדריך). השתדל להשאיר את קצה הטיפ כל הזמן בתוך הנוזל, כדי למנוע היווצרות קצף, והעלה והורד את הנוזל שוב ושוב עד שלא נראים יותר גושי חיידקים בתרחיף. החלף טיפ ובצע כנ"ל גם למבחנה השניה. 1. הוספת תמיסה מס' 2: הלבש טיפ כחול והוסף 2 מיקרוליטר של "תמיסה מספר Buffer) 2 "(D2 לכל אחת מהמבחנות. ערבב את המבחנות בעדינות ע"י היפוכן 1 פעמים. הדגר את המבחנות בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות בלבד. 11. הוספת תמיסה מס' 3: כוון את הפיפטור של 1 ל- 3 מיקרוליטר והלבש טיפ כחול. הוסף 3 מיקרוליטר של "תמיסה מספר Buffer) 3 (D3 " לכל אחת מהמבחנות. ערבב את המבחנות בעדינות ע"י היפוכן 1 פעמים. לאחר ביצוע שלב זה התמיסה מכילה תאים מפורקים - תוכל להבחין בהיווצרות גושים לבנים. ה - DNA הפלסמידי מורחף בתמיסה. 2 3 1 1
שלב ג' : ניקוי תרחיף התאים המפורקים בשלב זה נרחיק מולקולות גדולות (בין השאר DNA כרומוזומלי) מתוך תרחיף התאים. 12. השקעת מולקולות גדולות המצויות בתרחיף התאים: סרכז את המבחנות בצנטריפוגה במשך 3 דקות במהירות של 13, סל"ד בטמפ' החדר. לאחר ביצוע שלב זה ה - DNA הפלסמידי מומס בנוזל העליון. שלב ד': קשירת ה DNA הפלסמידי ל ממברנת הקולונה בשלב זה ה DNA הפלסמידי ייקשר לממברנת הקולונה, בעוד ששאר המרכיבים יהיו חופשיים בתמיסה. שים לב! יש על השולחן שני סוגים של מבחנות אפנדורף: ללא מכסה ועם מכסה. המבחנות ללא מכסה שקופות ובעלות צבע אחיד. כאשר, הינך מתבקש להשתמש במבחנה ללא מכסה, עליך לסמן בנוסף למספרים 2, 1, גם את שם הקבוצה על מנת לא להתבלבל עם שאר הקבוצות. 2,1 סימון מבחנות : סמן שתי מבחנות אפנדורף גדולות שקופות ללא מכסה במספרים.13 ורשום גם את שם הקבוצה. 14. הכנס קולונה לכל אחת מהמבחנות. כיוון הפיפטור: כוון את הפיפטור של 1 ל - 6 מיקרוליטר והלבש טיפ כחול. 6 1.1 העברת התמיסה לקולונה : שאב בזהירות את הנוזל העליון תוך הקפדה לא לגעת במשקע. שים לב לא לשפוך את הנוזל, משום שה DNA הפלסמידי נמצא בנוזל!!! העבר את הנוזל לתוך הקולונה שבמבחנת האפנדורף שסימנת. החלף טיפ ובצע כנ"ל גם למבחנה השנייה. (את המבחנות עם המשקע יש לזרוק לאשפה הבקטריולוגית)..16 17. קישור ה- DNA לקולונה : סרכז את המבחנות, בעזרת המדריך, בצנטריפוגה במשך 3 שניות במהירות של 8, סל"ד בטמפרטורת החדר. זכור כי הדנ"א קשור לקולונה. השלכת נוזל השטיפה מהמבחנה : הפרד בין המבחנות לבין הקולונות ושפוך את הנוזל לתוך האשפה הבקטריולוגית. לאחר מכן, הכנס שוב את הקולונה אל המבחנות והעמד את המבחנות במעמד המבחנות..18
שלב ה': שטיפת הדנ"א הפלסמידי שלב זה כולל שימוש בשתי תמיסות שונות: תמיסה מספר :4 Buffer) (W1 תמיסה מספר : Buffer) (Wash תמיסות השטיפה מכילות : אתנול, בופר Tris HCl ו - acetate otassium מטרת שלב זה היא לשטוף את הדנ"א משאריות של מלחים, אשר עלולים לפגוע ביעילות האנזים הפועל בשלב הבא של המעבדה. כיוון הפיפטור: כוון את הפיפטור של 1 מיקרוליטר טיפ כחול. ל 4 מיקרוליטר הוספת תמיסת שטיפה : הוסף 4 מיקרוליטר של תמיסה מס' Buffer) 4 W1) הקולונות. והלבש אל מרכז שטיפת הדנ"א : סרכז את המבחנות, בעזרת המדריך, למשך 3 שניות בטמפרטורת החדר במהירות 8, סל"ד. השלכת נוזל השטיפה : הסר את הקולונות מהמבחנות, רוקן את תכולת המבחנות אל תוך האשפה הבקטריולוגית והחזר את הקולונות למבחנות. כיוון הפיפטור : כוון את הפיפטור של 1 מיקרוליטר טיפ כחול. ל 6 מיקרוליטר והלבש הוספת תמיסת שטיפה : הוסף 6 מיקרוליטר של תמיסה מס' Buffer) (Wash אל מרכז הקולונות. שטיפת הדנ"א : סרכז את המבחנות, בעזרת המדריך, למשך 3 שניות בטמפרטורת החדר במהירות 8, סל"ד. השלכת נוזל השטיפה : הסר את הקולונות מהמבחנות, רוקן את תכולת המבחנות אל תוך האשפה הבקטריולוגית והחזר את הקולונות למבחנות. הסרת שאריות נוזל השטיפה: בטמפרטורת החדר במהירות 13, סל"ד. סרכז את המבחנות, בעזרת המדריך, דקות 2 למשך השלכת נוזל השטיפה : הסר את הקולונות מהמבחנות, רוקן את תכולת המבחנות אל תוך האשפה הבקטריולוגית והחזר את הקולונות למבחנות. 4 6 1 1.19.2.21.22.23.24.2.26.27.28 שלב ו' : ניתוק ה DNA הפלסמידי מהקולונה בשלב זה נוסיף מים לקולונות. המים יגרמו להקטנת האפיניות הפלסמידי ולכן הדנ"א ישתחרר מהקולונה וישטף ביחד עם המים. (משיכה) בין הקולונה לדנ"א.1,2 סימון מבחנות: סמן 2 מבחנות אפנדורף, קטנות צבעוניות, במספרים.29 העברת הקולונות: הישנות לכלי האשפה הבקטריולוגית. העבר את הקולונות למבחנות החדשות שסימנת וזרוק את המבחנות כיוון הפיפטור : כוון את הפיפטור של 1 מיקרוליטר והלבש טיפ לבן. ל מיקרוליטר 1.3.31
3. הוספת מים :.32 הוסף בזהירות מיקרוליטר מים DDW) או (Elution Buffer אל מרכז פתח הקולונה. במידה והמים נשארו על דופן הקולונה הורד אותם ע"י נקישות קלות של המבחנה ע"ג השולחן. בצע כנ"ל גם עבור המבחנה השניה. 31. סירכוז: סרכז למשך שתי דקות במהירות של 13, סל"ד בטמפ' החדר (העזר במדריך). הפרדת הבקטריולוגי. הקולונות: 33. איחוד ה :DNA כוון פיפטור של 1 הפרד בזהירות את הקולונות מהמבחנות והשלך את הקולונות לפח ל מיקרוליטר בקולונה ולכן נפח הנוזל הסופי יכול להיות פחות מהנפח ההתחלתי). העבר את הנוזל עם ה DNA שבמבחנה מס' 1 למבחנה מס' 2. זרוק את מבחנה מס' 1. 34. סימון מבחנות: והלבש טיפ לבן (חלק מהנוזל נספג סמן שתי מבחנות אפנדורף קטנות באותיות A ו- B. מבחנות אלה תשמשנה אותנו לחלק השני של המעבדה אלקטרופורזה בג'ל..3 חלוקת ה - :DNA כוון פיפטור של 2 ל 1 מיקרוליטר. העבר 1 מיקרוליטר ממבחנה מס' 2 למבחנה A. העבר 1 מיקרוליטר ממבחנה מס' 2 למבחנה B. כוון פיפטור של 2 ל 6. מיקרוליטר. הוסף 6. מיקרוליטר מים למבחנה A. כוון פיפטור של 2 ל. מיקרוליטר. הוסף. מיקרוליטר מים למבחנה B. הכנס את המבחנות 36. סימון מבחנה: A ו B לסל הקרח. סמן מבחנת אפנדורף קטנה כ המעבדה טרנספורמציה..37 חלוקת ה - :DNA.DNA כוון פיפטור של 2 ל 1 מיקרוליטר. העבר 1 מיקרוליטר ממבחנה מס' 2 למבחנה המסומנת הקרח. מבחנה זו תשמש אותנו לחלק השלישי של DNA והכנס את המבחנה לסל 1 הנוזל שהתקבל מכיל דנ"א פלסמידי שישמש אותנו הן לאנליזה בעזרת אלקטרופורזה בג'ל (חלק 2) והן לטרנספורמציה של הפלסמיד לחיידקים קומפיטנטים (חלק 3). הכנס את מבחנה מס' 2 לסל הקרח. 1 1 6 2 2 2 2
תקציר הפקת ה- DNA שלב א': השקעת חיידקים : תרחיף חיידקים סירכוז דקות 13, סל"ד זורקים נוזל עליון משקע שלב ב': פיצוץ עדין של החיידקים: הוספת תמיסות מספר 3 2, 1, שלב ג': ניקוי תרחיף החיידקים: סירכוז 3 דקות 13, סל"ד זורקים משקע נוזל עליון שלב ד': קישור DNA לקולונה: העברה דרך קולונה שנמצאת במבחנת אפנדורף סירכוז 3 שניות במהירות של 8 סל"ד זורקים הנוזל מהמבחנות שלב ה': שטיפת ה DNA בקולונה: שטיפת הקולונה בבופרים 4, כולל סירכוזים זורקים הנוזל מהמבחנות שלב ו': שיחרור ה DNA מהקולונה: העברת הקולונות למבחנות נקיות שטיפה ב DDW סירכוז 2 דקות 13, סל"ד זורקים הקולונה קבלת נוזל המכיל DNA פלסמידי
חלק 2: אלקטרופורזה בג'ל שלב א': חיתוך הפלסמיד בחלק זה נבצע אנליזה של ה DNA שהופק, באמצעות הרצה על ג'ל. בין השאר נשווה בין ה- DNA שהפקנו זה עתה לבין DNA זהה שהופק בשיטות אחרות. DNA פלסמידי יכול להיות מאורגן בצורות מרחביות שונות. אירגונו המרחבי של הפלסמיד משפיע על מהירות ריצתו בג'ל ככל שהפלסמיד דחוס יותר הוא ירוץ מהר יותר וההיפך. גם מידת ניקיונו של הפלסמיד משפיעה על מהירות ריצתו בג'ל. פלסמיד בעל רמת ניקיון נמוכה יכלול גם מולקולות שונות שלא הוסרו כמו שצריך במהלך ההפקה, פלסמיד שכזה ירוץ לאט יותר בג'ל. 1. הוספת אנזים הרסטריקציה EcoRI למבחנה שמסומנת A: המדריך יוסיף למבחנה A את החומרים הבאים (נמצאים אצל המדריך): 1 מיקרוליטר של אנזים הרסטריקציה.EcoRI 2. מיקרוליטר של בופר. ערבב קלות בעזרת הפיפטור. 2. הוספת אנזימי רסטריקציה EcoRI ו- ScaI למבחנה שמסומנת B: המדריך יוסיף למבחנה B את החומרים הבאים (נמצאים אצל המדריך): 1 מיקרוליטר של אנזים הרסטריקציה.EcoRI 1 מיקרוליטר של אנזים הרסטריקציה.ScaI 2. מיקרוליטר של בופר. ערבב קלות בעזרת הפיפטור. 3. הורדת התמיסה לתחתית המבחנה : הכנס את המבחנות לצנטריפוגה ל שניות במהירות 14, סל"ד..4 הדגרה ב - :37 C הכנס את המבחנות לסירה והדגר לכל הפחות 3 דקות ב 37 C (רשום לעצמך את הזמן בו התחילה ההדגרה). בזמן ההמתנה החל בביצוע חלק - 3 טרנספורמציה. שלב ב': הכנת הדגימות להרצה בג'ל באלקטרופורזה בג'ל תריץ מספר דוגמאות: א. דגימה 1 הפלסמיד puc 19 שהופק מחיידקים על ידנו ונחתך באנזים הרסטריקציה.(A)EcoRI ב. דגימה 2 הפלסמיד puc 19 שהופק מחיידקים על ידנו ונחתך באנזימי הרסטריקציה.(B) ו- ScaI EcoRI ג. דגימה 3 הפלסמיד puc 19 שהופק בשיטה אחרת ונחתך באנזים הרסטריקציה. EcoRI ד. דגימה 4 הפלסמיד puc 19 שהופק בשיטה אחרת ונחתך באנזימי הרסטריקציה EcoRI ו- ScaI. ה. דגימה מס' סמן המשמש לקביעת משקל מולקולרי. הסמן מורכב מ - DNA של בקטריופאג' למבדא שנחתך ע"י אנזים הרסטריקציה.HindIII
הכנת דגימה DNA) A שהפקת וחתכת ב- EcoRI ) להרצה בג'ל: כוון פיפטור של 2 מיקרוליטר 2 ל- 3 מיקרוליטר. הוסף למבחנה A (שהדגרת ב 37 C) 3 מיקרוליטר של צבע לג'ל. ערבב קלות בוורטקס. הורד את כל החומר לתחתית המבחנה ע"י נקישה עדינה בשולחן. הכנת דגימה DNA) B שהפקת וחתכת ב- ScaI+EcoRI ) להרצה בג'ל: הוסף למבחנה B 3 3 מיקרוליטר של צבע לג'ל. ערבב קלות בוורטקס. הורד את כל החומר לתחתית המבחנה ע"י נקישה עדינה בשולחן. שלב ג': הטענת הדגימות על הג'ל כיוון פיפטור: אין לגעת בג'ל בידיים חשופות - הג'ל מכיל חומר מסרטן!! כוון פיפטור של 2 ל- 2 מיקרוליטר והלבש טיפ קטן. פתיחת הג'ל: בעזרת המדריך פתח את עטיפת הג'ל היבש והנח אותו במתקן הג'לים. צד ימין של הקסטה נכנס ראשון. ההטענה - למניעת ייבוש. ביצוע : prerun יש לפתוח את עטיפת הג'ל סמוך ככל האפשר לזמן בצע prerun (לקסטה עם מסרק בפנים) על ידי לחיצה ממושכת על הלחצן (שתי שניות). צפצוף קצר ואור ירוק מהבהב יאשרו הפעלה תקינה. כעבור שתי דקות האור יהפוך לאדום מהבהב וישמע צפצוף מקוטע. יש ללחוץ על הלחצן, עד להופעת אור אדום קבוע. העמסת הדגימות: הוצא את המסרק והעמס את שתי הדגימות שלך. אל תשכח להחליף טיפ בין דוגמא לדוגמא. רשום לעצמך איזו דגימה העמסת בכל בארית. העמסת דגימות ביקורת:.11.12.13 המסחרי החתוך. המדריך יעמיס את סמן הגודל, הפלסמיד המסחרי והפלסמיד אתחול הרצת הג'ל: להתחלת הריצה, לחץ לחיצה קצרה על הכפתור. אור ירוק קבוע יעיד על הפעלה נכונה. תן לג'ל לרוץ בין 1 ל- 3 דקות. התבונן בריצת הצבע, אך אל תגע במכשיר. סיום ההרצה: בתום ההרצה, האור הירוק יהפוך לאדום וישמע צפצוף מקוטע. 2 2 צילום הג'ל: המדריך יוציא את הג'ל ממתקן ההרצה ויעבירו לשולחן.UV לאחר שנקבל תמונה טובה, יצלם המדריך את הג'ל. סמן הגודל:
ה. חלק 3: טרנספורמציה של חיידקים קומפטנטים עבודה זאת מתבצעת בתנאים סטריליים. עליך לעבוד ליד אש גלויה. הזהר מאוד! הרחק חומרים דליקים מהאש, כולל ניירות. תלמידים עם שיער ארוך מתבקשים לאסוף את שיערם. הטרנספורמציה תבוצע עם שני סוגים של DNA פלסמידי: א. DNA פלסמידי אשר הופק על ידכם על פי התהליך שתואר לעיל וסומן כ -.DNA ב. DNA פלסמידי זהה שהופק בשיטה אחרת באופן מסחרי וסומן כ- +. בנוסף, נבצע טרנספורמציה ללא פלסמיד (ביקורת שלילית). מבחנה זו תסומן כ. חשוב לאיזה צורך מבצעים טרנספורמציה של DNA מסחרי ותמיסה ללא.DNA בעזרת המדריך עמוד על ההבדלים בין ביקורת שלילית לביקורת חיובית. שלב א' : הוספת ה DNA הפלסמידי לתאים קומפטנטיים 1. הכנת התאים הקומפטנטיים לביצוע הטרנספורמציה: בסל הקרח מבחנה של תאים קומפטנטיים (מסומנת באות C). בדוק שהנוזל במבחנה הפשיר. במידה ולא, הוצא את המבחנה מסל הקרח לזמן קצר ככל האפשר. הכנת המבחנות: ברשותך שתי מבחנות המכילות DNA פלסמידי: מבחנה אחת שסימונה DNA שהכנת בחלק הראשון של המעבדה.. מבחנה זו מכילה DNA פלסמידי זהה לזה שהפקת בחלק מבחנה שניה שסימונה + הראשון של המעבדה אשר נקנה מחברה מסחרית. המבחנות נמצאות בסל הקרח. העבר אותן למעמד המבחנות. הכנת מבחנה ללא :DNA סמן מבחנת אפנדורף נוספת כ והנח אותה במעמד המבחנות. מבחנה זו תעבור תהליך זהה למבחנות DNA ו +אך ללא.DNA הוספת מים: כוון את הפיפטור של 2 הוסף למבחנה המסומנת כ- כוון את הפיפטור של 2 + הוסף למבחנה המסומנת כ- כוון את הפיפטור של 2 הוסף למבחנה המסומנת כ- ל- 1 מיקרוליטר, 1 מיקרוליטר של מים. ל- 1 מיקרוליטר, 1 מיקרוליטר של מים. ל- מיקרוליטר 1 1 והלבש טיפ לבן. והלבש טיפ לבן. והלבש טיפ לבן., DNA מיקרוליטר של מים. 2 2 2 [הערה: כמות הבופר אינה זהה בשלוש המבחנות משום שהנפח הסופי של כל התמיסות חייב DNA להיות זהה (2 מיקרוליטר) וכמות ה המוספת לכל מבחנה שונה. הסיבה להבדל DNA- בכמויות ה DNA אותן אנו מוסיפים למבחנות + ו DNA היא ריכוז ה- DNA הקנוי מרוכז יותר מה- DNA אותו אנו מפיקים ולכן מוהלים אותו במים. [
הוספת התאים ל :DNA כוון את הפיפטור של 1 ל- 6 מיקרוליטר והלבש טיפ לבן. 6 1 חלק לשלוש המבחנות ( 6 מיקרוליטר תאים קומפטנטיים לכל מבחנה,+,DNA ) באופן סטרילי. ערבב את שלוש המבחנות בעדינות ע"י תיפוף באצבע. התערובת על גבי דפנות המבחנות. היזהר מיצירת בועות או פיזור שלב ב' : החדרת ה - DNA לתאים הדגרת התאים בקרח : שוק חום: שוק קור: שים את המבחנות במעמד "סירה" עגול והדגר את המבחנות בקרח במשך 2 דקות. בזמן ההדגרה המשך לבצע במידת האפשר את חלק 2 הכנת הדגימות להרצה על ג'ל. כיוון פיפטור: קרב את סל הקרח עם המבחנות אל אמבט 42 C הכנס את המבחנות לאמבט למשך 9 שניות בדיוק. העבר מיד את הסירה עם המבחנות לקרח והדגר במשך כוון את הפיפטור של 1 הרחפת התאים במצע גידול: ל- 4 מיקרוליטר 6 שניות בדיוק. והלבש טיפ כחול. הוסף באופן סטרילי ליד אש, 4 מיקרוליטר של תמיסה מס' 9 המבחנות. (מצע גידול (LB לכל ערבב בעדינות רבה ע"י נקישת אצבע בדופן המבחנה. זרוק את הטיפ לשקית של פסולת בקטריולוגית. ביטוי הגן המקודד לעמידות לאנטיביוטיקה אמפיצילין: שים את המבחנות בתוך סירה. סדר את הסירה בתוך תופש ארלנמייר באמבט של 37. C הדגר תוך כדי טלטול קל במשך 1-3 דקות. חזור לחלק 2 להשלמת העבודה. 4 1 זכויות שמורות למרכז נוער ע''ש בלמונטה
שלב ג' : זריעת חיידקים על מצע מוצק הזריעה מבוצעת ע"י פיזור נפח מסוים מתרבית החיידקים שעברו טרנספורמציה למצע גידול מוצק המצוי בצלחות. החיידקים יזרעו הן על מצע ללא סלקציה, האנטיביוטיקה אמפיצילין המשמשת לסלקציה של הטרנספורמטים. והן על מצע המכיל כמו כן, את מכיל מצע הסלקציה סובסטראט (X-gal) שמפורק ע"י האנזים ביתא-גלקטוזידאז ותוצר הפירוק שמתקבל הוא בעל צבע כחול. לפניך שש צלחות פטרי המכילות מצע גידול מוצק כאשר שלוש צלחות מתוך השש עטופות בנייר כסף. צלחות אלו מכילות במצע הגידול את החומרים: אמפיצילין ו -.X-gal הסובסטרט,(X-gal) שתוצר הפירוק שלו כחול, רגיש לאור ולכן תמיד יש להגן עליו בעזרת נייר כסף. שלוש הצלחות הנוספות, המשמשות כצלחות ביקורת, אינן מכילות אמפיצילין ו -.X-gal סימון הצלחות : סמן את הצלחות העטופות בתחתיתן: DNA מצע סלקטיבי, + מצע סלקטיבי, מצע סלקטיבי. הוסף את שמך ותאריך. סמן את צלחות הביקורת בתחתיתן : DNA מצע ביקורת, + מצע ביקורת,.13.14 מצע ביקורת. הוסף את שמך ותאריך. כוון פיפטור: כוון את הפיפטור של 1 זריעת הצלחות: א. העברת החיידקים לצלחות : העבר ל- מיקרוליטר הזריעה מבוצעת באופן סטרילי, מיקרוליטר של חיידקים מהמבחנה המסומנת כ והלבש טיפ לבן. ליד אש, DNA - DNA" מצע סלקטיבי". העבר מיקרוליטר נוספים לצלחת DNA" מצע ביקורת" וזרוק את הטיפ. ב. מריחת החיידקים בצלחת : בשני שלבים: לתוך מרכז צלחת הוצא ליד האש מקל מקופל (מקל דרגלסקי) ומרח בעזרתו היטב את החיידקים שזרעת על צלחת DNA" מצע ביקורת". סגור את הצלחת. מרח בעזרת אותו מקל את צלחת DNA" מצע סלקטיבי". את המקל המשומש הנח במיכל הפלסטיק הגדול. 1 חזור על שני השלבים עם הצלחות האחרות. אל תשכח להחליף טיפ ומקל דרגלסקי בזמן המעבר בין דוגמאות ה DNA השונות. הדבק את כל הצלחות יחדיו בעזרת סלוטייפ. אל תדביק את הצלחות מסביב. הדגר את הצלחות ב 37 C למשך 24 שעות וצפה בהופעת מושבות חיידקים. אל תשכח לעטוף חזרה את הצלחות שהיו עטופות בנייר כסף.
עיבוד תוצאות טרנספורמציה וסלקציה א. אומדן מספר התאים החיים בדוגמא שנזרעה: מנה את מספר המושבות המופיעות על צלחת הביקורת. עשה זאת הן לגבי הצלחת בה נזרעו חיידקים שעברו טרנספורמציה ע"י ה - DNA שהפקת, והן לגבי הצלחת בה נזרעו החיידקים שעברו טרנספורמציה ע"י DNA פלסמידי שהופק בשיטה אחרת באופן מסחרי. ב. קביעת אחוז טרנספורמנטים המבטאים עמידות לאמפיצילין : מנה את מספר המושבות המופיעות על צלחות המכילות אמפיצילין ו -.X-gal ספור הן את המושבות הכחולות והן את המושבות הלבנות. עשה זאת הן לגבי הצלחת בה נזרעו חיידקים שעברו טרנספורמציה ע"י ה - DNA שהפקת והן לגבי הצלחת בה נזרעו החיידקים שעברו טרנספורמציה ע"י DNA פלסמידי שהופק בשיטה אחרת באופן מסחרי. היחס בין מספר המושבות בסעיף ב' לבין מספר המושבות בסעיף א', כפול מאה ייתן את אחוז הטרנספורמנטים המבטאים עמידות לאמפיצילין. ג. קביעת אחוז טרנספורמנטים המבטאים את האנזים ביתא-גלקטוזידאז: מנה את מספר המושבות הכחולות המופיעות על צלחות המכילות אמפיצילין ו -.Xgal עשה זאת הן לגבי הצלחת בה נזרעו חיידקים שעברו טרנספורמציה ע"י ה - DNA שהפקת, והן לגבי הצלחת בה נזרעו החיידקים שעברו טרנספורמציה ע"י DNA פלסמידי קנוי. היחס בין מספר המושבות בסעיף ג' לבין מספר המושבות בסעיף א', כפול מאה ייתן את אחוז טרנספורמנטים המבטאים את האנזים ביתא-גלקטוזידאז. ערוך טבלה מסכמת. שאלות: 1) כיצד תוכל להסביר את השוני במספר מושבות החיידקים על שלוש הצלחות? השווה בין סידרת הצלחות שנזרעה ע"י חיידקים שעברו טרנספורמציה עם DNA שהפקת לבין חיידקים שעברו טרנספורמציה ע"י DNA קנוי. 2) אילו גורמים עשויים להשפיע על יעילות תהליך הטרנספורמציה? 3) בד"כ בודקים את ה - DNA שהופק באלקטרופורזה בג'ל לפני ביצוע טרנספורמציה. הסבר מדוע. זכויות שמורות למרכז נוער ע''ש בלמונטה